МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПОЧВЫ

Дата введения: с момента утверждения

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Заместителем главного государственного санитарного врача Российской Федерации — Главным врачом Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н.Беляевым 24.12.2004 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

Область применения

1. Область применения

Настоящий документ является методической базой для осуществления государственного санитарно-эпидемиологического надзора за санитарным состоянием почв населенных мест, сельскохозяйственных угодий, территорий курортных зон и отдельных учреждений. Документ предназначен для лабораторий учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, а также лабораторий других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения указанных испытаний.

Нормативная ссылка

1.1. Почва, очистка населенных мест, бытовые и промышленные отходы, санитарная охрана почвы. Санитарно-эпидемиологические правила и нормы СанПиН 2.1.7.1287-03
1.2. ГОСТ 17.4.3.01-83. Общие требования к отбору проб почвы
1.3. ГОСТ 17.4.4.02-84. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа
1.4. МУ 2.1.7.730-99 Гигиеническая оценка качества почвы населённых мест
1.5. МУ по санитарно-микробиологическому анализу лечебных грязей N 143-9/316-17
1.6. МУК 4.2.1018-01 Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды

Санитарно-бактериологические показатели почвы и их нормирование

Санитарное состояние почвы — совокупность физико-химических, биологических свойств почвы, определяющих качество и степень её безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношении.
Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от ее глубины. В поверхностном слое почвы (0-10 см) количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажности почвы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10-30 см. На глубине 1 м выявляются единичные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд клеток на 1 г почвы), наименее — почва, бедная влагой и органическими веществами (200 млн клеток в 1 г).
Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т.п.) и в санитарно-защитных зонах по санитарно-бактериологическим показателям, которые делятся на косвенные и прямые:

1) Косвенные характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это — санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечной палочки (общие колиформные бактерии) и энтерококки. В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и как следствие, высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов, санитарное число), свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфицирования. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое содержание вегегативных форм С. perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

2) Прямые санитарно-бактериологические показатели эпидемической опасности почвы — обнаружение возбудителей кишечных инфекций (патогенные энтеробактерии, энтеровирусы).
Результаты анализов оцениваются в соответствии с таблицей N 1.

Таблица 1

Оценка степени эпидемической опасности почвы

Категория загрязненности почв	Индекс БГКП	Индекс энтерококков	Патогенные бактерии, в т.ч. сальмонеллы	Яйца геогельминтов, экз/кг	Личинки-Л и куколки-К мух, экз. в почве с площадью 20×20 см
Чистая
Умеренно опасная				до 10	Л — до 10 К — отс
Опасная				до 100	Л — до 100 К — до 10
Чрезвычайно опасная	1000 и выше	1000 и выше			Л>100 К>10

Почву оценивают как «чистую» без ограничений по санитарно-бактериологическим показателям при отсутствии патогенных бактерий и индексе санитарно-показательных микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы.
О возможности загрязнения почвы патогенными энтеробактериями свидетельствует индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП (колиформ) и эктерококков 10 и более клеток/г почвы.
При необходимости углублённой оценки санитарного состояния почвы и способности ее к самоочищению исследуются показатели биологической активности почвы. Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), клостридии, термофильные бактерии, грибы и актиномицеты, аммонификаторы, аэробные целлюлозные микроорганизмы и т.д.
Перечень показателей определяется целями исследования, природой и интенсивностью загрязнения, характером землепользования.

Отбор проб для бактериологического анализа

Контроль загрязнения почв населённых пунктов проводится с учётом функциональных зон города. Места отбора проб предварительно отмечаются на картосхеме, отражающей структуру городского ландшафта. Отбор проб осуществляется согласно ГОСТ 17.4.4.01-83* «Общие требования к отбору проб почвы»; ГОСТ 17.4.4.02-84 «Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа». На территорию, подлежащую контролю, составляют описание с указанием адреса, точки отбора, общего рельефа микрорайона, расположения мест отбора и источников загрязнения, растительного покрова, характера землепользования, уровня грунтовых вод, типа почвы и других данных, необходимых для правильной оценки и трактовки результатов анализов образцов.
_______________
* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 17.4.3.01-83. — Примечание изготовителя базы данных.
Отбор проб для бактериологического анализа проводится не менее 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязнения органическими отходами. При изучении динамики самоочищения почвы отбор проводят в течение первого месяца еженедельно, а затем ежемесячно в течение вегетационного периода до завершения активной фазы самоочищения.
Пробная площадка — часть исследуемой территории, характеризующаяся сходными условиями (рельефом, однородностью структуры почвы и растительного покрова, характером хозяйственного использования).
Пробная площадка должна располагаться на типичном для изучаемой территории месте. На площади 100 м закладывается одна пробная площадка размером 25 м. При неоднородности рельефа площадки выбирают по элементам рельефа.
Точечная проба — материал, взятый из одного места горизонта или одного слоя почвенного профиля, типичный для данного горизонта или слоя.
Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев или горизонтов методом конверта. Выкапывается шурф 0,3 м х 0,3 м и глубиной 0,2 м. Поверхность одной из стенок шурфа очищают стерильным ножом. Затем из этой стенки вырезают почвенный образец, размер которого обусловлен заданной навеской, так, если необходимо отобрать 200 г почвы, размер образца 20 см х 3 см х 3 см, 500 г — 20 см х 5 см х 3 см.
Точечные пробы отбирают ножом, шпателем или почвенным буром.

Объединённую пробу составляют путём смешивания точечных проб, отобранных на одной пробной площадке.
Для бактериологического анализа с одной пробной площадки составляют 10 объединённых проб. Каждую объединённую пробу составляют из трёх точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных послойно с глубины от 0 до 5 см, от 5 см до 20 см.
Пробы почвы, предназначенные для бактериологического анализа, в целях предотвращения их вторичного загрязнения следует отбирать с соблюдением правил асептики: отбирают стерильными инструментами, перемешивать на стерильной поверхности, помещая в стерильную тару. Время от отбора проб до начала их исследования не должно превышать 1 суток.
При изучении воздействия пестицидов и др. химических веществ на микрофлору и процессы самоочищения в более глубоких слоях почвы, для отбора проб почвы пользуются шурфом глубиной до 1 м. Пробы отбирают из стенки шурфа стерильным инструментом через каждые 10 см.
Для контроля санитарного состояния почв детских дошкольных, школьных и лечебно-профилактических учреждений, игровых площадок и зон отдыха отбор проб проводят не менее 2-х раз в год — весной и осенью. Размер пробной площадки должен быть не более 5×5 м.
При контроле санитарного состояния почв территорий детских учреждений и игровых площадок отбор проб проводится отдельно из песочниц и с общей территории с глубины 0-10 см.
С каждой песочницы отбирается одна объединённая проба, составленная из 5 точечных проб. При необходимости возможен отбор одной объединённой пробы из всех песочниц каждой возрастной группы, составленной из 8-10 точечных проб.
Пробы почвы отбирают либо с игровых территорий каждой группы (одна объединённая из не менее пяти точечных), либо одна объединённая проба с общей территории из 10 точечных, при этом следует учитывать наиболее вероятные места загрязнения почв.
При контроле почв в районе точечных источников загрязнения (выгреба, мусоросборники и т.д.) пробные площадки размером не более 5×5 м закладываются на разном расстоянии от источника и в относительно чистом месте (контроль).
При изучении загрязнения почв транспортными магистралями пробные площадки закладываются на придорожных полосах с учётом рельефа местности, растительного покрова, метео- и гидрологических условий.
Пробы почвы отбирают с узких полос длиной 200-500 м на расстоянии 0-10, 10-50, 50-100 м от полотна дороги. Одна смешанная проба составляется из 20-25 точечных проб, отобранных с глубины 0-10 см.
При оценке почв сельскохозяйственных территорий пробы почвы отбирают 2 раза в год (весна, осень) с глубины 0-25 см. На каждые 0-15 га закладывается не менее 1 площадки размером 100-200 м в зависимости от рельефа местности и условий землепользования.
На территории крупных городов с многочисленными источниками загрязнения проводят геохимическое картирование по сети апробирования. Для выявления очагов загрязнения рекомендуется плотность отбора 1-5 проб на 1 км с расстоянием между точками отбора 400-1000 м. Для дальнейшего выделения территории с максимальной степенью загрязнения сеть апробирования сгущается до 25-30 проб на 1 км с расстоянием между точками отбора около 200 м пробы отбирают с глубины 0-5 см.
Отобранные пробы необходимо пронумеровать и зарегистрировать в журнале, указав следующие данные: порядковый номер и место взятия пробы, рельеф местности, тип почвы, целевое назначение территории, вид загрязнения, дату отбора.
Пробы должны иметь этикетку с указанием места и даты отбора пробы, номера почвенного разреза, почвенной разности, горизонта и глубины взятия пробы, фамилия исследователя.

Оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды

6.1.* Оборудование

_____________
* Нумерация соответствует оригиналу. — Примечание изготовителя базы данных.

—	Термостат для температурного режима (37±1) °С
—	Баня водяная с подогревом до температуры 100±2 °С
—

Stylab / Каталог / Микробиология / Колиформы (БГКП)

СТАЙЛАБ предлагает тест-системы для анализа колиформных бактерий (БГКП) в пробах пищевых продуктов, а также на рабочих поверхностях, инструментах и других объектах.

Микробиологический метод анализа, тест-подложки HS8791 / HS8792 Compact Dry CF HS8781 / HS8782 Compact Dry EC

Микробиологический метод анализа, метод отпечатка	HS0411/HS0412 RIDA®STAMP Coliform
	HS0431/HS0432 RIDA®STAMP ECC

общее микробное число

Колиформные (колиморфные) бактерии, или бактерии группы кишечной палочки (БГКП) – это собирательное название некоторых энтеробактерий, обладающих общими чертами. К БГКП обычно относят кишечную палочку (E. coli), клебсиелл (Klebsiella), энтеробактер (Enterobacter), цитробактер (Citrobacter) и гафний (Hafnia), однако иногда в эту группу включают сальмонелл, шигелл, иерсиний и другие бактерии.

Энтеробактер – это факультативно анаэробные подвижные грамотрицательные неспорообразующие палочковидные бактерии, присутствующие в кишечниках многих млекопитающих, а также в воде и почве. Некоторые из них, например, Enterobacter cloacae, были выделены из корней растений. Они являются возбудителями пищевых токсикоинфекций, а также раневых инфекций и инфекций мочевыводящих путей. Чаще всего заболевания, вызванные Enterobacter, встречаются у людей со сниженным иммунитетом.

Клебсиеллы – это грамотрицательные неподвижные палочковидные бактерии, имеющие капсулу, которая защищает их от воздействий среды. Помимо кишечника, они встречаются на коже и слизистых оболочках, в воде, почве и растениях, в т.ч. во фруктах, овощах, цветах и древесине. У человека клебсиеллы вызывают кишечные инфекции, инфекции дыхательных путей, включая пневмонию, а также конъюнктивиты и менингиты; у животных, помимо этого, маститы. Термо- и кислотостабильный энтеротоксин клебсиелл по действию аналогичен термостабильному энтеротоксину кишечной палочки.

Цитробактер – это грамотрицательные подвижные палочковидные бактерии. обитающие в воде, почве и пищевых продуктах. Многие из них являются условно-патогенными и вызывают оппортунистические инфекции. К примеру, Citrobacter freundii ассоциируют с такими заболеваниями, как менингиты новорожденных, абсцессы мозга и печени и др.

Некоторые бактерии рода цитробактер обладают множественной устойчивостью к антибиотикам, что повышает их потенциальную опасность.

Гафния – это род грамотрицательных палочек, обитающих в организмах человека, птиц и пчел, а также в почве и воде. Бактерию Hafnia alvei часто выделяют из холодных мясных продуктов в вакуумной упаковке, меда, молочных продуктов, пресноводной рыбы, реже из овощей. Гафнии вызывают заболевания домашней птицы, сопровождающиеся потерей аппетита, снижением продуктивности, катаральными энтеритами, диареей и мультифокальными некротизирующими гепатитами. Известны случаи септицемии у птиц и радужной форели.

Для человека эти бактерии являются условно-патогенными. Данные об энтеритах, вызываемых гафниями, противоречивы; в настоящее время считается, что эти микроорганизмы являются вероятными возбудителями гастроэнтеритов. Гафнии вызывают инфекции дыхательных и мочеполовых путей, а также абсцессы.

БГКП являются санитарно-показательными микроорганизмами, указывающими на вероятность присутствия в пробе патогенных бактерий. Отдельным санитарным показателем являются фекальные (или термотолерантные) колиформы. К ним относятся определенные штаммы БГКП. Присутствие в пробе этих организмов указывает на фекальное загрязнение. По выделенным бактериям можно определить его давность.

В Российской Федерации и странах Таможенного Союза содержание БГКП в пищевых продуктах ограничено ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции», ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» и другими техническими регламентами. С актуальной законодательной информацией можно ознакомиться на сайте compact24.com.

Для определения колиформных бактерий используют микробиологические методы. Поскольку у них есть общие свойства, для анализа БГКП удобно использовать селективные среды.

Литература

←Вернуться

Определение общих колиформных бактерий (БГКП)

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) давно уже считаются удобными микробными индикаторами. Показатель «бактерии группы кишечных палочек» (БГКП) приведен в соответствие с принятой международной номенклатурой, который идентичен показателю «общие колиформные бактерии». К колиформам относятся грамотрицательные бактерии, имеющие форму палочек, способных развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста и способных ферментировать лактозу при t (35 — 37 °C) с образованием кислоты, газа и альдегида, то есть на среде Эндо лактозоположительные колонии дают отпечаток в течение 24 — 48 ч. Они оксидазоотрицательные и не образуют спор.

Бактерии группы кишечной палочки включают следующие роды: эшерихия, клебсиелла, энтеробактер, цитробактер и серрации.

При анализе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется проводить определение титрационным методом. В качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв рекомендуется использовать метод мембранной фильтрации. При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения можно проводить прямой поверхностный посев разведения суспензии на поверхность среды Эндо.

Для исследования используют предварительно подготовленные почвенные суспензии и разведения по описанной выше методике.

Титрационный метод определения индекса БГКП (колиформ) в почве

Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 куб. см, засевают во флаконы с 90,0 куб. см жидкой лактозо-пептонной среды (ЛПС) или среды Кесслера, что соответствует засеву 1 г почвы. Соотношение между навеской почвы или ее эквивалентным разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации — 1:1.

Посев меньших количеств (0,01 г, 0,001 г, то есть 10(2), 10(3) и т.д.) делают по 1,0 куб. см из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9,0 куб. см тех же сред. Титрование проводят до разведения 1:1000000, то есть 10(6) с регулярной сменой пипеток при переходе от одного разведения к другому. Посевы инкубируют в течение 48 ч при (37 +/- 1) °C, через (24 +/- 2) ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Отсутствие газообразования и помутнения через 48 ч инкубации выдают окончательный отрицательный ответ.

При наличии в посевах признаков роста: помутнения и газообразования или только помутнения — производится высев на поверхность среды Эндо.

Чашки с посевами помещают в термостат на (18 — 24) ч при температуре (37 +/- 1) °C. При отсутствии роста на чашках выдают отрицательный ответ. При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний, малиновых с металлическим блеском или без него проводят микроскопию колоний с последующей постановкой оксидазного теста. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от бактерий рода Pseudomonoas и других видов сапрофитных бактерий. Микроскопирование и постановка оксидазного теста проводится по МУК 4.2.1018-01.

При наличии оксидазоотрицательных грам (-)палочек по 2 — 3 колонии каждого типа засевают параллельно в 2 пробирки в полужидкую или жидкую с поплавком среду с лактозой, разлитую в пробирки в количестве 4,0 — 5,0 куб. см, для подтверждения ферментации лактозы при температуре (37 +/- 1) °C. Учет производят через 18 ч инкубации. Если за это время происходит образование кислоты и газа, это свидетельствует о наличии бактерий группы кишечных палочек. Признаком газообразования является появление пузырьков газа, об образовании кислоты свидетельствует изменение цвета среды. При появлении только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного ответа еще на 24 ч, при отсутствии газообразования через этот срок выдают окончательный отрицательный ответ, при появлении газообразования — положительный ответ. После выявления БГКП устанавливают титр, при этом принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживаются колиформы. Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр. Так, при титре 0,01 индекс равен 100, а при титре 0,1 индекс равен 10.

Определение БГКП в почве методом мембранной фильтрации

В качестве ускоренного метода для обнаружения колиформных бактерий целесообразно использовать метод мембранных фильтров.

Для микробиологических целей используются фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества. Метод основан на фильтрации установленного объема — 5,0 — 10,0 куб. см почвенной суспензии первого разведения (1:10) — через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной, питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам. Для того чтобы облегчить фильтрование почвенной суспензии через мембранный фильтр, желательно до фильтрования провести предварительную обработку.

Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.

Подготовка фильтровального аппарата

Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой.

В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем, затем создают вакуум.

При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.

Следует начинать с фильтрования проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы. После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо с добавлением розоловой кислоты, разлитую в стерильные чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Эта среда используется только при работе методом мембранной фильтрации. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 — 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие БГКП в исследуемой почве.

Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к БГКП.

Для подтверждения наличия БГКП исследуют:

— все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;

— не менее 3 — 4 колоний каждого типа.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

— наличие оксидазной активности;

— принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);

— ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Для расчета индекса количества бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме почвы, умножают на 1000 и делят на этот объем.

Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета БГКП в почве

При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 куб. см на поверхность среды Эндо и немедленно равномерно распределять по поверхности шпателем. Посев при анализах сравнительно чистых почв производится из разведении от 1:10 до 1:1000, то есть от 10(1) до 10(3). При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 10(6). Посевы выращивают в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению общих колиформных бактерий титрационным методом и подсчету количества колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножается на степень десятикратного разведения.